　　实验前需严格核查试剂盒有效期，确保酶标板、酶结合物、标准品、底物等组件完整无破损，且均在规定温度下储存。实验室环境需保持清洁干燥，温度控制在20-25℃，避免强光直射与交叉污染。同时，准备好移液器、洗板机、酶标仪等设备，校准移液器精度，确保洗板机通道通畅，酶标仪波长校准合格。样本需新鲜采集，血清样本分离后避免反复冻融，若需保存应置于-20℃以下，检测前恢复至室温并充分混匀。

　　（二）核心操作步骤

　　加样：按试剂盒说明书要求，将标准品、阴性对照、阳性对照及待测样本依次加入酶标板孔中，每孔加样量需精准一致（通常为50-100μL），避免气泡产生。加样后轻轻振荡酶标板，确保样本与包被抗原/抗体充分接触，随后置于37℃温育箱中孵育20-60分钟（具体时间依试剂盒说明调整）。

　　洗板：温育结束后，弃去孔内液体，用洗涤液充分洗涤酶标板3-5次，每次浸泡1-2分钟，最后一次洗涤后需将酶标板倒置在吸水纸上拍干，避免残留洗涤液影响反应结果。洗板是去除非特异性结合物的关键步骤，操作不当易导致假阳性。

　　加酶结合物：向各反应孔中加入规定量的酶结合物，轻轻振荡混匀后，37℃温育15-30分钟，使酶标记物与特异性结合物形成免疫复合物。

　　二次洗板：重复洗板步骤，清除未结合的酶结合物，降低背景信号干扰。

　　显色反应：向每孔加入底物溶液，避光室温孵育10-20分钟，底物与酶发生催化反应，产生有色产物。显色过程需严格控制时间，避免显色过度或不足影响结果判读。

　　终止反应：当标准品梯度显色清晰时，加入终止液终止反应，轻轻振荡混匀，确保反应终止，此时颜色由蓝色转为黄色（TMB底物系统）。

　　（三）实验后处理

　　检测完成后，及时清理实验台面，酶标板、样本废弃物等按生物安全规范分类处理，避免污染环境。仪器设备需清洁保养，记录实验数据与操作过程，便于结果追溯。

　　二、结果判读与质量控制

　　（一）判读方法

　　定性检测：以阴性对照平均吸光度值（A值）的2.1倍作为临界值（Cut-off值），待测样本A值≥临界值为阳性，＜临界值为阴性。若阳性对照A值未达到试剂盒规定标准，或阴性对照A值过高，提示实验可能存在污染或操作失误，需重新检测。

　　定量检测：以标准品浓度为横坐标，对应的A值为纵坐标，绘制标准曲线，通过曲线拟合计算待测样本中抗原/抗体的浓度。标准曲线相关系数（R²）需≥0.98，确保拟合效果良好，否则需重新制备标准品进行检测。

　　（二）质量控制要点

　　实验过程中需设置阴性对照、阳性对照及空白对照，空白对照用于扣除背景吸光度值。若出现对照结果异常，需排查试剂失效、加样错误、洗板不好等问题。同时，平行检测样本需保证结果一致性，变异系数（CV）应＜10%，确保检测结果的重复性与可靠性。

　　三、注意事项

　　操作过程中需严格遵循试剂盒说明书，不得随意更改温育时间、加样量等参数。移液器使用时需更换吸头，避免交叉污染；酶结合物、底物等试剂需现配现用，避免反复冻融。检测人员需做好个人防护，穿戴实验服、手套等防护用品，防止生物样本感染。此外，酶标仪需定期校准，确保检测波长准确性，洗板机需定期维护，避免通道堵塞影响洗涤效果。

　　规范的Elisa操作流程与科学的结果判读是疾病防控血清学检测的核心保障。在实际应用中，需强化质量控制意识，严格执行操作规范，及时排查实验误差，确保检测结果准确可靠，为疾病监测、疫情防控及临床诊断提供有力支撑。

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