哈特兰德病毒HLV抗体快速检测卡

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A 2 氢氧化钠消化法

取氢氧化钠35-40g，钾明矶2g，嗅麝香草酚蓝20mg(预先用60%酒精配制成0.4%浓度，应用时按比例加入)，蒸馏水1000 mL混合，即为氢氧化钠消化液。

将被检的痰、尿、粪便或病灶组织按1:5的比例加入氢氧化钠消化液中，混匀后，37°C作用2-3 h，然后无菌滴加5%-10%盐酸溶液进行中和，使标本的pH 调到6.8左右(此时显淡黄绿色)，以3000-4000 r/min离心15-20 min，弃上清，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。

在病料中加入等量的4%氢氧化钠溶液，充分摇荡5-10 min，然后用3000 r/min离心15-20 min，弃上清，加1滴酚红指示剂于沉淀物中，用2 mol/L盐酸中和至淡红色，然后取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。

在痰液或小脓块中加入等量的1%氢氧化钠溶液，充分振摇15 min，然后用3000 r/min离心30 min，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。

对痰液的消化浓缩也可采用以下较温和的处理方法：取1mol/L (或4% )氢氧化钠水溶液50 mL，0.1mol/L柠檬酸钠50 mL，N-乙酞-L-半胧氨酸0.5g，混合。取痰一份，加上述溶液2份，作用24-48 h，以3000 r/min离心15min，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。

如果要用ΔΔCT方法进行后的计算，就需要目的基因和内参基因有相近的扩增效率。较好的引物扩增效率应该在90%-110%，且线性回归系数R2大于0.98。

4、引物生产工艺

引物在生产的过程中一般都会有大约0.01%的错误可能（根据不同生产商，会略有差异）。除此之外，还有副产物（脱盐纯化）以及大量盐分（尤其是page纯化），虽然这不一定影响PCR实验，但是可能会导致实验不稳定。一般在临床试剂中使用的引物和探针都会尽量避免这个问题，而绝大多数科研引物都常常忽略这个问题。

5、引物是否跨内含子

在核酸抽提的过程中，抽提的RNA往往还有少量的DNA（根据不同的抽提试剂盒以及操作本身，比例不同），因此也会对实验结果产生影响。一般跨内含子的引物可以有效区分RNA和DNA样本。可以只检测RNA里的基因表达。

6、引物设计在靠近5'端还是3'端

一般来说，受反转录效率和mRNA降解偏好性差异的影响，靠近3'端的引物能够更好的反映基因的表达情况。

痰液或乳汁等样品，由于含菌量较少，如直接涂片镜检往往是阴性结果。此外，在培养或作动物试验时，常因污染杂菌生长较快，使病原结核分枝杆菌被抑制。下列几种消化浓缩方法可使检验标本中蛋白质溶解、杀灭污染杂菌，而结核分枝杆菌因有蜡质外膜而不死亡，并得到浓缩。

A 1 硫酸消化法

用 4%-6%硫酸溶液将痰、尿、粪或病灶组织等按1:5之比例加入混合，然后置37°C，作用1-2 h。经3000-4000 r/min离心30 min，弃上清，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。也可用硫酸消化浓缩后，在沉淀物中加入3%氢氧化钠中和，然后抹片镜检、培养和接种动物。