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裂谷热病毒ELISA检测试剂盒(酶联免疫法)

裂谷热病毒ELISA检测试剂盒(酶联免疫法)

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裂谷热(RVF)是由裂谷热病毒引起的,经蚊类媒介或接触传播的急性病毒性人畜共患病,主要影响的是动物,但也能传染人。初始的症状有:发热、头痛、疲劳、关节和肌肉疼痛,有时会有恶心、呕吐,部分患者会出现结膜炎及畏光的现象;严重者可能会导致出血、休克、脑炎或肝炎,甚至是死亡。裂谷热病毒ELISA检测试剂盒(酶联免疫法)

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裂谷热病毒ELISA检测试剂盒(酶联免疫法)

广州健仑生物科技有限公司

裂谷热(RVF)是由裂谷热病毒引起的,经蚊类媒介或接触传播的急性病毒性人畜共患病,主要影响的是动物,但也能传染人。初始的症状有:发热、头痛、疲劳、关节和肌肉疼痛,有时会有恶心、呕吐,部分患者会出现结膜炎及畏光的现象;严重者可能会导致出血、休克、脑炎或肝炎,甚至是死亡。

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裂谷热病毒ELISA检测试剂盒(酶联免疫法)

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(2)着丝粒(centromere,CEN):有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点,使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在YAC中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。如pYAC4使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。

(3)自主复制序列(autonomously replication sequences,ARS):一段特殊的序列,含有酵母菌中DNA进行双向复制所必须的信号。

(4)标记基因。YAC载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因,如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因trp1、leu2和his3、尿嘧啶合成缺陷型基因ura3等,以及赭石突变抑制基因sup4。与YAC载体配套工作的宿主酵母菌(如AB1380)的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade 2-1。带有这个突变的酵母菌在基础培养基上形成红色菌落,当带有赭石突变抑制基因sup4的载体存在于细胞中时,可抑制ade 2-1基因的突变效应,形成正常的白色菌落。利用这一菌落颜色转变的现象,可用于筛选载体中含有外源DNA片段插入的重组子。

三、YAC载体的工作原理

YAC 在结构上能模拟酵母染色体的线状DNA分子。将大片段的基因组DNA连接到YAC载体的两个“臂”上,然后将连接产物通过转化的方法导入酵母菌,这样就构成了重组的YAC。每一条臂分子中都携带一个选择标记以及按适当方向排列的起端粒作用的DNA序列。另外,其中一条臂上还携带着丝粒DNA序列以及复制子序列。因此在重组的YAC中,外源基因组DNA片段的一侧为着丝粒、复制子及选择标记,另一侧为第二种选择标记。通过在选择性琼脂平板上生长的菌落可鉴定出已转化并稳定保持人工染色体的酵母转化子。

 

在 YAC载体中最常用的是pYAC4。由于酵母的染色体是线状的,因此其在工作状态也是线状的。但是,为了方便制备YAC载体,YAC载体以环状的方式存在,并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记,以便保存和增殖。

YAC载体主要是用来构建大片段DNA文库,特别用来构建高等真核生物的基因组文库,并不用作常规的基因克隆。下图是以pYAC4为例如,当用BamHI切割成线状后,就形成了一个微型酵母染色体,包含染色体复制的必要顺式元件,如自主复制序列、着丝粒和位于两端的端粒。对于BamHI切割后形成的微型酵母染色体,当用EcoRI或SmaI切割抑制基因sup4内部的位点后形成染色体的两条臂,与外源大片段DNA在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体,通过转化进入到酵母菌后可象染色体一样复制,并随细胞分裂分配到子细胞中去,达到克隆大片段DNA的目的。

酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)

装载了外源DNA片段的重组子导致抑制基因sup4插入失活,从而形成红色菌落;而载体自身连接后转入到酵母细胞后形成白色菌落。这些红色的装载了不同外源DNA片段的重组酵母菌菌落的群体就构成了YAC文库。

四、YA载体的优缺点

YAC载体虽然功能强大,但有一些缺点,主要表现在3 个方面:

(1)在YAC载体的插入片段会出现缺失(deletion)和基因重排(rearrangement)现象。

(2)容易形成嵌合体。嵌合就是在单个YAC中的插入片段由2个或多个的独立基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的5-50%。

(3)YAC染色体与宿主细胞的染色体大小相近,影响了YAC载体的广泛应用。YAC染色体一旦进入酿酒酵母细胞,由于其大小与内源的染色体的大小相近,就很难从中分离出来,不利于进一步分析。

但是YAC载体也具有一些突出的优点:

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